纖維素（CLL）含量試劑盒說明書

                          可見分光光度法

注意： 正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格：50T/48S

正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起，是植物細(xì)胞

壁的主要結(jié)構(gòu)成分。纖維素是一種重要的膳食纖維，是自然界中分布最廣、含量最多的 一種多糖。

測(cè)定原理：

纖維素為β －葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成β －葡萄糖。β －葡萄糖在強(qiáng)酸作 用下，可脫水生成β －糠醛類化合物。β －糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合，生成糠醛衍生物。顏色的深  淺可間接定量測(cè)定纖維素含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、80％乙醇、丙酮、濃硫酸（不 允許快遞） 、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一： 液體 50mL× 1 瓶，4℃保存。

試劑二： 粉劑×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三： 液體 10mL× 1 支，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品： 粉劑10mg× 1支，4℃保存； 含 10mg 無水葡萄糖（干燥失重<0.2%），臨用前加入 1mL 蒸餾水溶解，配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液備用，4℃可保存 1 周，或者用飽和苯甲酸溶液溶解， 可保存更長(zhǎng)時(shí)間。

樣品的前處理：

1 、細(xì)胞壁的提取： 取約 0.3g 樣本（計(jì)為M1），加入 1mL 80％乙醇，室溫快速勻漿，95℃水浴      20min ，冷卻至室溫，4000g 25℃離心 10min ，棄上清。沉淀加入 1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍  （渦旋振蕩 2min 左右，4000g 25℃離心 10min ，棄上清即可） ，沉淀即為粗細(xì)胞壁，加入 1mL 試 劑一（去除淀粉） 浸泡 15 小時(shí)，4000g 25℃離心 10min ，棄上清，1mL 80％乙醇洗滌兩次，棄上 清，將沉淀干燥，稱重得細(xì)胞壁物質(zhì)（CWM質(zhì)量計(jì)為M2）。

2 、纖維素的提取： 稱取烘干的 CWM 約 5mg（計(jì)為W），加入 0.5mL 蒸餾水充分勻漿，勻漿液轉(zhuǎn)移 至 EP 管中，用蒸餾水定容至 0.5mL ，置于冰水浴中，緩慢加入 0.75mL 濃硫酸，混勻，冰水浴中 靜置 30min 。8000g 4℃離心 10min ，取上清液，用蒸餾水稀釋 20 倍后待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)備：

將10mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行二倍稀釋得到 0.2、0. 1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、 0.00156mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

測(cè)定步驟：

1 、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 620nm ，蒸餾水調(diào)零。

本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！ 請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途！

2 、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3 、工作液的配制： 在試劑二中加入 4mL 試劑三，充分溶解，如較難溶解，可加熱攪拌； 用 不完的試劑 4℃保存一周；

4 、加樣表（在 EP 管中反應(yīng)） ：

混勻，置 95度水浴中 10min（蓋緊，以防止水分散失） ，冷卻至室溫后，于 620nm 處讀數(shù)。 纖維素含量計(jì)算：

1 、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

以 0.2 、0. 1 、0.05 、0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.00156mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐

標(biāo)，ΔA 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程 y=kx+b ，將ΔA′代入方程得到 x（mg/mL）；

2 、按細(xì)胞壁干重計(jì)算

纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W

3 、按總樣本質(zhì)量計(jì)算

纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W×（M2÷M1）

V 提取： 提取后體積，1.25mL；W：樣品質(zhì)量，mg；稀釋倍數(shù)： 20；M1：總樣本質(zhì)量，g； M2：細(xì)胞壁物質(zhì)CWM ，g

注意事項(xiàng)

1. 加熱過程中有劇烈反應(yīng)，震蕩時(shí)輕搖，以免壓力過大噴出造成人生傷害。

2. 濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，建議戴防護(hù)手套操作。

3. 如樣本OD值大于1.5 ，可在纖維素提取過程中擴(kuò)大稀釋倍數(shù)，計(jì)數(shù)過程中乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

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