孕酮快速檢測試劑盒使用說明書

【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物孕酮和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭孕酮抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孕酮的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較可得出相應(yīng)殘留物孕酮的含量。

【試劑盒技術(shù)指標】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間：75min

樣本定量檢測下限

組織（蝦、魚）……………………………………0.1ppb

豬肉/肝 雞肉/肝 …………………………………… 1ppb

飼料………………………………………………… 4ppb

奶液…………………………………………………1ppb

交叉反應(yīng)率

孕  酮………………………………………………100%

雌二醇……………………………………………< 0.1%

雌三醇…………………………………………… < 0.1%

樣本回收率

飼  料……………………………………………90±10%

組  織……………………………………………85±10%

奶  液……………………………………………70±10%

【試劑盒組成】   

1、微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb

3、高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb

3、酶標記物    12ml………………………………紅色帽

4、抗體工作液    7ml………………………………藍色帽

5、底物液 A液   7ml………………………………棕色帽

6、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

7、終 止 液         7ml……………………………… 黃色帽

8、20X濃縮洗滌液  40ml…………………………白色帽

9、2X濃縮復溶液   50ml…………………………藍色帽

【所用儀器、試劑】   

儀器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試   劑：乙腈、正己烷、氯化鈉

【實驗前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃

               縮復溶液+1份去離子水）用于樣本的復溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照

              1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按

             所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（a）飼料樣本

1、 稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min；

2、 取2ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干；

3、 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入1ml稀釋后的復溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心10min，

不同樣本按如下方法稀釋：

配合料：取50µl，加入450µl稀釋后的復溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。

濃縮料/預(yù)混料：取50µl，加入950µl稀釋后的復溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。

配合料稀釋倍數(shù)：20       

濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù)：40

（b）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）

1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入1克氯化鈉和6ml乙腈，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min。

2、 取3ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干。

3、 用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，

不同樣本按如下方法稀釋：

       蝦魚：直接取50µl下層水相用于檢測。

       豬肉/肝、雞肉/肝：取50µl下層水相加入450µl稀

       釋后 的復溶液，渦動混合30s；取50µl用于檢測。

       樣本的稀釋倍數(shù)：

       蝦魚稀釋倍數(shù)：1      

       豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：10

（c）牛奶高檢測限處理方法；

1、 取2ml奶液到離心管中，加入3克氯化鈉，和6ml乙氰，強烈振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min，直至清亮；

2、 移取3ml上清液至干凈的試管中，60℃氮氣/空氣吹干；

3、 用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心10min;

4、 取50µl下層水相用于檢測分析。

       樣本的稀釋倍數(shù)：1

（d）牛奶低檢測限處理方法；

1、 直接取50µl牛奶+450µl稀釋后的復溶液混合30s；

2、 取50µl用于檢測分析。

        樣本稀釋倍數(shù)：10

【酶標免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

【結(jié)果判定】   

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含孕酮成負相關(guān)。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；0.1ppb為1.320；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660； 2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孕酮實際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以孕酮濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孕酮實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）   

3、標準曲線

B/B0 (%)

                                      孕酮(ppb) [µg/kg]

                         圖1：孕酮檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性

%CV

                          孕酮(ppb) [µg/kg]

                圖2：孕酮檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出孕酮檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)孕酮濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。

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