CCK-8試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中待測物質水平。用純化的待測物質抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入待測物質，再與HRP標記的待測物質抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測物質呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中待測物質濃度。

　　CCK-8試劑盒的技術流程：

　　1、用緩沖液將抗體稀釋至1-10ug/ml。在反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次。

　　2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.05ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。

　　3、加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體0.05ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

　　4、加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5、終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6、結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　CCK-8試劑盒使用注意事項：

　　（1）所有試劑應按照適合溫度儲存。請勿反復凍融。

　　（2）使用后均需要對操作區進行消毒，消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除劑等。耗材均需使用商品化的無酶耗材。

　　CCK-8試劑盒樣本注意事項：

　　（1）細胞在含/不含血清的環境中均可直接使用試劑盒。

　　（2）擴增2kb以內片段，細胞樣品濃度不超過1000個細胞。如若擴增片段超過2kb，可適當提高細胞濃度。

　　（3）不同組織使用不同的眼科剪和眼科鑷進行處理，防止交叉污染導致檢測結果偏差。

　　CCK-8試劑盒使用過程中注意事項：

　　（1）PCR過程中推薦使用陰性對照和陽性對照。

　　（2）整個過程中使用的吸頭、離心管等耗材應丟棄在含有75%乙醇或核酸消除劑的容器中，防止形成環境污染。

　　（4）PCR產物3’末端含有A，可直接進行TA克隆。