恩諾沙星

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

    試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物恩諾沙星藥物和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗恩諾沙星藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留恩諾沙星藥物的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物恩諾沙星藥物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：      1ppb

u 孵育溫度：          25℃

u 孵育時間：          30min～15min

u 樣本檢測下限

恩諾沙星檢測下限      ····················  1ppb

u 交叉反應率

恩諾沙星   ··························    100%

u 樣本回收率

組織 /雞蛋 ···································  80±15%

血   清  ······································  80±15%

蜂   蜜  ······································  75±15%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul、單道100～1000ul、多道 250 ul

試      劑：濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉、Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a） 本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b） 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

u 樣本前處理需配制：

配液1  0.1M HCL溶液：  

        860µl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。

配液2  乙腈-二氯甲烷混合溶液：

         V_乙腈：V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液3  pH7.2  0.02M PB緩沖液：      

   5.16g Na₂HPO₄·12H₂O + 0.87g NaH₂PO₄·2H₂O  

    加去離子水1L溶解。

配液4  乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液

100ml乙腈-二氯甲烷(V_乙腈：V_二氯甲烷  = 4 :1） 混合溶液中加入5ml 0.1M HCl溶液。

配液5  用去離子水將2X濃縮復溶液按1：1稀釋  

（1份濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本復溶。

（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等）雞蛋

1、稱2.0±0.05g 均質過的組織樣本于50ml離心管中；

2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取4ml有機相至干燥容器中，56℃氮氣吹干/旋轉蒸發至干；

4、用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

5、去除上層取下層50µl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數：1

（b）血清樣本的處理

1、用加有肝素鈉（20-30單位/ml血）的離心管采集雞血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后4000r/min以上，15℃離心10min，取出血漿1ml；

2、加入乙腈（無水）4ml上下充分混合5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、移上清至另一離心管中，加入2ml 0.02M PB緩沖液，混勻；

4、加入二氯甲烷5ml，充分混勻5min，4000r/min，15℃離心10min，去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發至干/氮氣吹干；

5、用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

6、輕吸掉上層和中間白色雜質，取下層相100µl加入100µl稀釋后的復溶液，混合30s；

7、取50µl用于分析。

       樣本稀釋倍數：2

（c）蜂蜜樣本處理方法：

1、 取2.0±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中；加入8ml乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液， 充分振蕩3min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

2、 取2ml上清液于56℃氮氣或空氣流吹干；

3、 加入1ml的樣本復溶液，充分震蕩1min；

4、 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數:  2倍

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

5、 將試劑盒從冷藏環境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

6、 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。

7、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

8、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔平行，并記錄標準孔的樣本孔所在的位置。

9、 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環境反應30min。

10、 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

11、 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環境避光顯色15min。

12、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定吸光度值（OD值）。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含恩諾沙星藥物量成負相關。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 1ppb為1.542；3ppb為1.130； 9ppb為0.635；27ppb為0.326； 81ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是27ppb - 81ppb；樣本2的濃度范圍是3ppb - 9ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中恩諾沙星藥物的實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以恩諾沙星標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中恩諾沙星藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲藏條件和保質期

1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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