SuperRT cDNA第--鏈合成試劑盒說明書

SuperRT cDNA Kit

目錄號：K0741

保存條件：-20℃保存。

組分說明

           Cat. No.                     K0741        K0741A

           Kit Size                        25            100

           SuperRT，200 U/μl               25 μl        100 μl

           5×RT Buffer                   120 μl        500 μl

           Primer Mix                     60 μl        240 μl

           dNTP Mix，2.5 mM Each          120 μl        500 μl

           RNase-Free Water               1 ml          1 ml

             本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產品簡介

　　本產品是專為兩步法RT-PCR第--步實驗配制的cDNA第--鏈合成試劑盒。該試劑

盒中使用的逆轉錄酶是一種利用大腸桿菌工程菌進行重組與表達的全新高效逆轉錄酶，

去除了RNase H活性并增強了其熱穩定性，可利用極低量的總RNA或mRNA合成cDNA

第--鏈，起始樣本量可低至pg級。SuperRT逆轉錄酶與RNA親合能力強，能通讀GC含

量高，二級結構復雜的RNA模板，獲得高產量的cDNA。

　　本產品包含從RNA模板逆轉錄成cDNA第--鏈所需的所有試劑，含有Super RT高效

逆轉錄酶、反應緩沖液、引物、dNTP等，使用簡單方便。本系統對后續的PCR以及定

量PCR試驗兼容性高，適用各種PCR反應的DNA聚合酶。

產品特點

·高效逆轉錄：與RNA模板親和力高，逆轉錄效率高達90%，可識別pg級別的模板。

·自由應對復雜模板：即使GC含量高，二級結構復雜的模板，無需高溫變性，也可得

  到良好結果。

·使用方便：試劑盒包含除RNA模板外的逆轉錄所需全部試劑。

注意事項

1．在操作過程中應避免RNase污染，防止RNA降解或實驗中的交叉污染，建議在專門

   的區域進行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口Z和一次性手套并經

   常更換手套。

2．實驗盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實驗中用到的無菌水應使用 0.1%的DEPC

   處理后進行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應盡快放回-20℃，避免反復凍融。

4．若起始RNA的量小于50  ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提

   供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。

使用方法

注意：1 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應體系，如果總RNA量大于5 μg，請按比例擴大反應體系。

 i逆轉錄操作步驟：

1．將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT  Buffer、SuperRT和RNase-Free Water

   溶解并置于冰上備用。

2．根據以下表格配置反應體系，總體積為20 μl。

試劑                            20 μl反應體系              終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each                 4  μl          500 μM Each

Primer Mix                           2  μl

RNA Template                         X  μl           50 pg-5 µg

5×RT Buffer                          4  μl               1×

SuperRT，200 U/μl                     1  μl

RNase-Free Water                 up to 20  μl

   注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。

   2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random Primer配制而成。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

4．42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

5．逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，或置于-20℃長期保存。

ii  若逆轉錄效率低，或RNA模板二級結構復雜、GC含量高時，建議采用以下步驟：

1．將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、RT  Buffer、SuperRT和RNase-Free Water

   溶解并置于冰上備用。

2．根據以下表格配置反應體系，總體積為15 μl。

試劑                           20 μl反應體系             終濃度

dNTP Mix，2.5 mM Each                 4  μl         500 μM Each

Primer Mix                           2  μl

RNA Template                         X  μl          50 pg-5 µg

RNase-Free Water                  up to 15  μl

3．70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。

4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

5．繼續向以上反應液中加入以下試劑：

試劑                        20 μl反應體系                 終濃度

5×RT Buffer                    4  μl                  1×

        注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：K0596。

        2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。

     6．輕輕吹打混勻，加入1 μl SuperRT（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。

     7．85℃孵育5分鐘。反應結束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

     8．逆轉錄產物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，或置于-20℃長期保存。

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